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TaqMan探针法qPCR原理及其主要应用
实时荧光定量PCR(简称qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质,利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用荧光化学物质的不同,qPCR可分为荧光染料法(SYBR Green Ⅰ法为代表)和荧光探针法(TaqMan法为代表)。
SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用简便,价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性,即染料可以与任何dsDNA结合。因此,qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值,影响定量结果的准确性,而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题下面,我们一起来了解一下TaqMan探针法qPCR的基本原理及其主要应用。

PART 01

TaqMan探针法qPCR原理


TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。其基本原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比,因此,通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的

图.TaqMan水解探针作用机理图.jpg
图. TaqMan水解探针作用机理图


PART 02

TaqMan探针法qPCR优点



 1   特异性高、定量准确

从原理可以看出,荧光探针只与目的序列结合,理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列,即不受非特异性产物的影响,因此,TaqMan探针法qPCR的特异性非常高,定量准确。


 2   实验耗时短

因探针法qPCR的高特异性,故无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何,大大缩短了实验时间。


 3   兼容多重反应

不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针,因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标,达到节省实验成本的目的。


PART 03

TaqMan探针法qPCR主要应用


正是由于上述优点,TaqMan探针法qPCR已被广泛地应用于科学研究和生产实践之中。有基础生物学研究、食品检测、医学检测与诊断等,尤其是在医学检测和诊断方面得到了大力地推广。因此本文重点介绍其在医学检测与诊断方面的应用。

 1   核酸定量分析

Taqman qPCR技术可对传染性疾病进行定量定性分析,包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等。

 2   基因表达差异分析

在现代生物医学的许多研究领域,从基础科学研究到药物研究的实际应用,检测基因表达情况都是基本的也是很重要的工作。Taqman qPCR技术可比较经过不同处理(如药物处理、物理处理、化学处理等)样本之间特定基因的表达差异,特定基因在不同时相的表达差异。

 3   基因型/等位基因分析

单核苷酸多态性(SNPs)是由DNA序列中同一个位置上的碱基对的常见替换造成的个体DNA序列差异。SNP在人类基因组中数量较多,发生频率较高,检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义。

与传统基因型分析方法相比Taqman qPCR技术具有高效率,低交叉污染等多方面优势,已成为SNP分型应用中最常用、最便捷的方法之一

 4   药物开发研究

在新药的开发过程中,快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金。
与以前所用的Elisa等方法相比TaqMan qPCR技术可以快速准确灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,为比较不同配方的疗效、用药量用药时间等提供快速准确的评价

 5   无创产前检查

到目前为止,人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,只能通过产前诊断,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生。
例如为减少X连锁遗传病患儿的出生,可从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,TaqMan qPCR检测其Y性别决定区基因。此外还可以通过TaqMan qPCR对孕妇弓形虫,梅毒等进行检测,这对找出不明原因流产和习惯性流产的病因提供有力的帮助,大大提高优生优育。

 6   肿瘤基因检测

尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。

TaqMan qPCR是一种有效的肿瘤前期检测及伴随诊断技术,涵盖癌症恶性肿瘤的预防及治疗。不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。

目前用此方法已进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。


 7   病原体检测

Taqman qPCR可以对多种病原体(如人类乳头瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒及非洲猪瘟病毒)进行定量测定。该技术对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态适用于传染病早期的大规模确诊

Taqman qPCR还可对病毒分型,例如可以鉴定特殊的HPV型别以及变异株,并对其进行针对性的处理,更有效预防宫颈癌。
此外,Taqman qPCR还可确定病毒载量。在抗病毒药物治疗监测的过程中,病毒载量是判断药物疗效的重要指标。如HIV的药物载量测定需通过Taqman qPCR技术来测定血液中HIV RNA的量,通过药物载量的高低变化可帮助判断HIV药物效果。


PART 04

112net永利|中国有限公司Taqman qPCR Mix在非洲猪瘟病毒检测的应用


非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性烈性高度接触性传染病其发病率和死亡率可达100%,严重危害着全球养猪业造成难以估量的经济损失。

目前非洲猪瘟没有疫苗和有效的治疗手段,qPCR法是OIE推荐使用的非洲猪瘟常规诊断的重要工具,也是中国在现阶段非洲猪瘟流行情况下首选的检测技术

112net永利|中国有限公司作为深耕于上游生命科学领域酶制剂的供应商,长期为IVD企业提供高品质、高性价比的原料(含可冻干原料),积极应对非洲猪瘟疫情,助力非洲猪瘟高效检测。


Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mixCat#11211)
2×Mix预混合试剂,含有基因改造的抗体法热启动Taq酶及深度优化的多重反应缓冲体系,可极大地提高扩增灵敏度和特异性。

产品特点:

 扩增灵敏度高 3 copies/反应可稳定检出

 超强的存储稳定性4℃、25℃、37℃放置7天反复冻融50次均性能稳定

 精密度高:CV<1%

 多平台适用:适用于市售各种荧光定量PCR仪

 支持多重检测:每孔反应至多可检测4-5个靶标

部分性能展示:

超高灵敏度,3 copies/反应稳定检出


图. 使用ASFV引物探针,对ASFV质粒(终体系3 copies)进行20个复孔的检测,比较各个品牌试剂的检出率,可以看到Yeasen qPCR mix的检出率更高。.jpg

图. 使用ASFV引物探针,对ASFV质粒(终体系3 copies)进行20个复孔的检测,比较各个品牌试剂的检出率,可以看到Yeasen qPCR mix的检出率更高。


PART 05

产品信息



产品类型

产品描述

产品名称

货号

探针法qPCR试剂

超高灵敏度

Hieff Unicon® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix

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全预混稳定性优化版(含UDG)

Hieff Unicon® C55P1 TaqMan Multiplex qPCR Master Mix (UDG plus)

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高GC含量扩增子扩增

Hieff Unicon® TaqMan multiplex qPCR master mix

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可冻干试剂盒

Hieff Unicon Lyo-TaqMan Multiplex qPCR Kit

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