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肿瘤筛查诊断之DNA甲基化检测

肿瘤是影响人类健康生活的重大疾病之一,随着人类平均寿命的延长,恶性肿瘤对人类的威胁日渐增加。随着疾病谱的改变,恶性肿瘤已经成为导致死亡的主要原因之一。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰,调节基因的表达和关闭,与癌症、衰老等许多疾病密切相关。

恶性肿瘤与肿瘤早筛



全球恶性肿瘤发病和死亡人数现状




根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)等发布的《2020年全球癌症数据》显示,2020年全球新发恶性肿瘤病例1929万例,死亡病例996万例,其中中国癌症新发病例456.9万例,死亡病例300.3万例,分别占全球新发与死亡病例的23.7%与30.2%。我国新发恶性肿瘤人数和恶性肿瘤死亡人数均位居全球第一。


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图1. 2020年全球癌症新发病例以及死亡病例分布(数据来源于IARC,东吴证券研究所)


肿瘤早筛可显著提高患者生存率




对于肿瘤来说,目前最好的防治策略就是早筛早诊,即早筛查、早诊断、早治疗。结直肠癌是中国发病数排名前三的癌种,以结直肠癌为例,其10年疾病发展期可分为癌前病变、结直肠癌I期、II期、III期、IV期,诊断时各自的5年生存率分别为100%、91.8%、82.4%、57%和10.8%。

由此可见,肿瘤的早筛早诊对于提升患者的生存率至关重要根据世界卫生组织数据,1/3的癌症可以通过早期发现得到治疗。

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图2. 结直肠癌疾病发展期示例(引自诺辉健康招股书)

DNA甲基化与肿瘤



DNA甲基化




DNA甲基化是基因表观遗传学修饰的一种重要方式,是指DNA甲基化转移酶(DNMT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。在哺乳动物中,DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛5′端胞嘧啶上,生成为5′甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m5C)。


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图3.DNA甲基化(图片来源于网络,侵删)

DNA甲基化与肿瘤发生




近年来的大量研究表明,DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展细胞癌变有着密切的联系主要原因在以下几个方面:1.甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶,造成基因突变;2.抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默;3.癌基因甲基化水平降低而活化;4.基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。

因此甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标,对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义

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图4.肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式(图片来源于网络,侵删)

DNA甲基化在肿瘤诊断中的应用




1

早筛早诊

由于细胞转化过程中的甲基化现象早于明显的恶性表型出现,甲基化研究可以用于肿瘤的早期诊断。与传统诊断方法相比,甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。

2

预后判定

甲基化改变与传统的预后指标之间存在密切联系,主要包括以下四个方面:1.甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。2.DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移。3.甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。4.甲基化影响生存期。

3

分子分型

在一个癌细胞中,可有多种基因同时被异常甲基化,每种肿瘤都有其自身一套异常甲基化基因,且某些基因异常甲基化具有肿瘤特异性。因此甲基化检测可用于肿瘤的分子分型。

DNA甲基化检测方法


随着DNA甲基化研究的不断深入,其检测方法也层出不穷。这些方法针对不同研究目的,运用不同处理方法,几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。

根据研究水平,这些方法大致可归为三大类:

1

基因组甲基化水平分析

如高效液相色谱法(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)。

2

候选基因甲基化分析

如甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法(MSRE-PCR/Southern)、重亚硫酸盐测序法(Bisulfite Sequencing)、甲基化荧光PCR(MethyLight)、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、焦磷酸测序等。

3

基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析

如限制性标记基因组扫描(RLGS)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、差异甲基化杂交(DMH)等。

我国甲基化检测试剂盒获证情况


近几年,基于DNA甲基化位点的检测试剂盒陆续获批面世。NMPA批准的甲基化检测试剂盒均为荧光PCR法,主要原因在于荧光PCR法操作简便无需在PCR后电泳,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点。

根据NMPA官网数据显示,目前甲基化检测试剂获得国家药监局注册证的国内企业有苏州为真、上海透景、博尔诚、厦门艾德、基因科技、杭州诺辉健康以及广州康立明等7家企业;甲基化检测种类涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4等;涉及的检测项目包括胃癌、结直肠癌、大肠癌、胶质瘤等。

表. NMPA批准的甲基化检测试剂盒

产品名称

生产厂家

注册证号

人septin9基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)

苏州为真生物医药科技有限公司

国械注准20183400103

人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒(PCR荧光法)

上海透景生命科技股份有限公司

国械注准20173403354

RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)

博尔诚(北京)科技有限公司

国械注准20203400447

人类SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)

厦门艾德生物医药科技股份有限公司

国械注准20213400007

septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)

博尔诚(北京)科技有限公司

国械注准20153401481

人类MGMT基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)

基因科技(上海)股份有限公司

国械注准20193400101

人类SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)

广州市康立明生命科技有限责任公司

国械注准20183400506

人septin9基因甲基化DNA检测试剂盒(PCR荧光法)

上海透景生命科技股份有限公司

国械注准20193400316

KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒(PCR荧光探针法-胶体金法)

杭州诺辉健康科技有限公司

国械注准20203400845

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