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看似简单的转化也是分子克隆中关键的一环

2022克隆王大赛数据审核阶段明天(5月20日)就截止啦。5月23日,克隆王大赛大众投票正式开启,投票从5月23日到5月27日,持续5天,同学们赶紧准备为自己拉票吧~


说到投票,就不得不提投票规则,同学们注意啦!在投票期间,每天每人仅能给1份实验数据投1票,最多可以给5份实验数据投票。


小翌温馨提醒:请勿使用刷票软件刷票,一经发现,将取消参赛资格。


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投票页面


这时,肯定有同学会问,那去哪里投票呢?

5月23日,投票渠道会在【112net永利|中国有限公司YEASEN】公众号菜单栏正式开放,记得保持关注哦~

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说完投票,小翌带大家进入今天的主题——转化。


转化是分子克隆的关键步骤,其目标是产生重组DNA分子的多个拷贝。在转化过程中,质粒DNA被引入到适当的菌株中,以便菌株可以复制目标序列,以用于后续进一步的分析或操作。转化通常有两种方法,分别为电转化和化学转化。化学转化是分子克隆实验中是最常用的转化方法。
 

化学转化实验步骤

 
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其核心步骤主要分为三步:


① 质粒DNA进入细胞;
② 细胞恢复;
③ 细胞接种培养。
 


质粒DNA进入细胞


常见的化学感受态细胞通常采用CaCl2法进行制备。感受态细胞的细胞膜磷脂双分子层因为钙离子的存在形成液晶结构,细胞壁的通透性发生变化,外源带负电荷的DNA会和带正电荷的钙离子吸附在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。42℃条件下,感受态细胞进入应激状态,细胞膜发生变化,出现许多间隙,吸附的DNA进入细胞。热冲击后,在低温条件下,间隙收缩。

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图片来源:Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation
 

注意事项:


1. 为保证良好的实验结果,建议选用转化效率在107cfu/ug以上的感受态细胞;

2. 加入的外源DNA量过多或者体积过大会使转化效率下降,建议加入体积不超过感受态细胞的十分之一;

3. 细胞避免反复冻融,长时间反复开关冰箱也会造成感受态细胞转化效率的下降;

4. 完成热冲击后,需迅速将感受态细胞置于冰上,保证DNA完全进入感受态细胞中。


 

细胞恢复


转化后的细胞需在无抗生素的液体培养基中进行培养,以保证外源DNA表达相关抗生素抗性基因,提高后续涂板细胞的活力和克隆效率。
 
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注意事项:


1. 该过程需在超净台中进行,无抗生素的培养基受到杂菌污染会影响转化效率,给后续实验造成不便;
2. 恢复时采用的液体培养基建议在37℃下预热,以保证细胞的恢复和生长,提高克隆阳性率;
3. 恢复的时间和转速根据所选用的感受态细胞而来,不同的感受态最优条件会有不同,建议参照商品说明书。
 


细胞接种培养


细胞的均匀分布对于菌落分析和后续筛选至关重要,选用灭过菌的涂布棒或者玻璃珠进行细胞扩散,需保证在细胞悬浮液干燥之前,完成细胞的均匀扩散。


注意事项:


1. 金属制涂布棒灭菌时若采用酒精灯灼烧灭菌,需等待涂布棒冷却后进行涂布接种;
2. 避免使用长时间存放的培养板,以保障抗生素活性、菌株生长营养所需;
3. 在细胞接种之前,应将培养基预热至适当的生长温度并且无冷凝水,以防止污染和混合菌落;
4. 避免长时间孵育。长时间孵育会导致大菌落融合,并且会在大菌落周围出现卫星菌落。
 
除了要了解实验步骤和注意事项外,选好感受态细胞也很重要!


112net永利|中国有限公司利用改良的生产菌株,采用严格的生产工艺,制备了高效、稳定、适用性广的高效感受态(>108 cfu/ug DNA)。另外,-80℃超低温冰箱保存,全程“三明治”结构的十斤干冰运输。多重保障帮您解决转化效率低的问题,助您轻松做转化,顺利做克隆。


产品优势


转化效率高:>108cfu/ug DNA
批次间稳定:批次间质量对比无差异
无杂菌污染:涂板培养无杂菌
无抗性偏好:各种抗生素均可适用
冷链运输:十斤干冰运输

产品性能


1. 感受态细胞批次间稳定强,转化效率高(>108cfu/ug DNA)


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图1. TOP10、DH5α和BL21三种感受态不同批次的转化效率稳定。


2. 感受态细胞无杂菌污染
 
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图2. 感受态细胞转化效率为>108cfu/ug DNA(A/B),感受态细胞涂布卡纳、羧苄平板上无杂菌污染(C/D/E/F)。



订购信息


应用场景

产品名称

货号

规格

高效感受态

TOP10 Chemically Competent Cell Top10化学感受态细胞

11801ES80

10×100 μL

DH5α Chemically Competent Cell DH5α化学感受态细胞

11802ES80

10×100 μL

BL21 (DE3) Chemically Competent Cell  BL21 (DE3)化学感受态细胞

11804ES80

10×100 μL

一步法快速重组克隆

Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒

10911ES20

20 T

Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit多片段一步法快速克隆试剂盒

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10 T

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆试剂盒

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20 T

高保真酶83倍Taq

Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

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100 U

2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液

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1 mL