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400-6111-883
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix
产品货号:11184ES03
产品规格:1 ml
产品价格:¥ 383.00
类别:染料法

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  • 产品信息

     

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

    11184ES03

    1 mL

    383.00

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

    11184ES08

    1 mL

    1653.00

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

    11184ES50

    50×1 mL

    12533.00

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

    11184ES60

    100×1 mL

    19833.00

     

    产品描述

     

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix2×实时定量PCR扩增的预溶液,具有高灵敏度和高特异性的特点,颜色为蓝色,具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动,可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量(30~70%)基因扩增的促进因子,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

    本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

     

    运输保存方式

     

    冰袋运输。-20避光储存,有效期18个月。

    本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。

    注意事项

    1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:11141ES),以有效去除RNA样品中残留的基因组。
    2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀,手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。
    3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。   

    4. 本产品仅作科研用途!

     

    反应体系

     

    组分

    体积(μL

    体积(μL

    终浓度

    Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

    25

    10

    Forward Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    模板DNA

    X

    X

    -

    无菌超纯水

    to 50

    to 20

    -

    使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

    a) 引物浓度通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况0.1-1.0 μM之间进行调整。

    b) 模板浓度:如模板为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10

    c) 模板稀释:cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20-30个循环为好。     

    d) 反应体系:推荐使用20 μL50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

    e) 体系配制:请于超净工作台内配制,使用无核酸酶残留的枪头、反应管推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

     

    标准程序

                                             

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95

    2 min

    1

    变性

    95

    10 sec

    40

    退火/延伸

    60

    30 sec

    熔解曲线阶段

    仪器默认设置

    1

     

    快速程序

     

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95

    30 sec

    1

    变性

    95

    3 sec

    40

    退火/延伸

    60

    20 sec

    熔解曲线阶段

    仪器默认设置

    1

     快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

    a) 退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。

    b) 荧光信号采集(★):请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:

    20 sec:Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

    31 sec:Applied Biosystems 7300

    32 sec:Applied Biosystems 7500

    c) 解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。

     

    结果分析

     

    定量实验至少需要三个生物学重复反应结束后需要确认扩增曲线及解曲线。

    1) 扩增曲线标准扩增曲线为S型。

    Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确

    Ct值小于10需要将稀释模板后,重新进行验;

    Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;

    Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。

    2) 熔解曲线

    熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。

    熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

    如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。

    如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。

     

    引物设计指南

     

    1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,可以在100 bp-300 bp内选择。

    2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2引物Tm值60-65为佳。

    3. 引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C

    4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现3个碱基以上的互补序列

    5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补

    6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析

     

    适用机型

     

    ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

    Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

    Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

    Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

    Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

    Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

    Thermo Scientific: PikoReal Cycler;

    Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR. 

     

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